I risultati non solo hanno dimostrato che l’acido retinoico diminuisce la crescita di queste cellule tumorali (effetto antiproliferativo), ma anche che le trasforma (effetto differenziante). Hanno cioè evidenziato le proprietà differenzianti dell’acido retinoico. Le cellule trattate con acido retinoico infatti, non solo diminuiscono la loro crescita, ma cambiano: perdono la capacità di formare colonie, non crescono in soft agar, non agglutinano se trattate con la lecitina Con A. Il trattamento dell’acido retinoico ha invertito le caratteristiche tipiche di cellule trasformate.

Gli autori affermano che : “Pertanto i risultati sono coerenti con il trattamento dell’acido retinoico che inverte lo stato neoplastico delle cellule” e “l’acido retinoico potrebbe aver soppresso il fenotipo trasformato con conseguente espressione di determinate proprietà associate alle cellule normali.”

Anche l’alterazione delle superfici cellulari indotta dell’acido retinoico è stata studiata studiando il legame della concanavalina A (Con A) a queste cellule.

Materiali e metodi

La linea cellulare di tumore cerebrale umano Gl-As-14(S) utilizzata in questo studio era una sottoclasse di Gl-As-14(ATCC-HTB-14). L’isolamento di questa linea cellulare è stato precedentemente descritto [11]. Le cellule sono state coltivate a 37°C con la soluzione di Hank contenente il 5% siero bovino fetale (FBS) e con aggiunta di glutammina, penicillina e streptomicina. L’acido all trans β retinoico (AR) e Con A provenivano da Sigma Chemicals (USA). La valutazione dell’inibizione della crescita dipendente e indipendente dall’ancoraggio indotta dall’acido retinoico è stata effettuata con il metodo riportato in precedenza [13]. Gli effetti inibitori della crescita dell’acido retinoico in colture seminate a diverse densità cellulari (0,5 x 10⁴ – 4 x 10⁴ cellule per piatto da 35 mm) sono stati studiati trattandole con 20 µM di acido retinoico per 7 giorni. Il ruolo delle diverse concentrazioni sieriche nel mezzo di crescita sull’inibizione della crescita indotta da acido retinoico è stato studiato seminando 2×10⁴ cellule in piastre di coltura da 35 mm in terreno contenente il 5% di siero bovino fetale (FBS). L’acido retinoico (20 µM) è stato aggiunto 24 ore dopo la placcatura in terreni integrati con FBS dal 2 al 8 % e le cellule sono state contate dopo 7 giorni di trattamento.

L’agglutinabilità mediata da Con A delle cellule Gl-As-14 (S) trattate e non trattate con acido retinoico è stata studiata utilizzando la tecnica dell’emoadsorbimento di Furmansky et al. [14]. Circa 1×10⁴ cellule sono stati seminate in una serie di piatti di coltura da 35 mm divisi in due gruppi, trattati con diverse concentrazioni di acido retinoico e Con A.

Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in serie triplicate di piastre e ogni esperimento è stato ripetuto 3 volte. Tutti gli esperimenti sono stati condotti in condizioni di luce soffusa.

Risultati

Abbiamo precedentemente riportato che l’acido retinoico ha indotto alterazioni morfologiche quando le cellule sono state coltivate in terreno integrato con 15 µM o 20 µM di acido retinoico [11]. Questo effetto inibitorio è stato ulteriormente studiato e i risultati che abbiamo osservato sono:

• 1) Inibizione della crescita cellulare indotta da acido retinoico
• 2) Effetto dose-dipendente dell’inibizione della crescita indotta da acido retinoico
• 3) L’acido retinoico ha indotto l’inibizione della crescita a diverse densità di semina cellulare
• 4) Inibizione della crescita indipendente dall’ancoraggio
• 5) Il trattamento con acido retinoico ha invertito caratteristiche tipiche di cellule maligne (effetto differenziante)

Discussione

I nostri risultati indicano che il trattamento delle cellule tumorali del cervello umano con acido retinoico nella coltura tissutale ha indotto alterazioni morfologiche [11], inibizione della crescita, ridotta formazione di colonie in agar molle. Abbiamo già riferito che le cellule trattate con acido retinoico hanno assunto un aspetto piatto a causa della maggiore diffusione cellulare e anche della ridotta sovrapposizione [11]. Questi effetti, che potrebbero essere considerati come ripristino del controllo della crescita dipendente dalla densità, sono simili a precedenti scoperte con cellule murine trasformate L-929 e fibroblastiche NILpy [3,17] così come cellule di carcinoma orale umano [13]. Anche l’inibizione della crescita delle cellule tumorali cerebrali umane da parte dell’acido retinoico è simile a quella già riportata con melanomi murini e umani, carcinomi mammari e orali [7,5,13] in quanto è dipendente dal tempo, dipendente dalla dose ed è reversibile. Inoltre, abbiamo dimostrato che l’effetto inibitorio della crescita dell’acido retinoico dipende dalla densità ed è anche influenzato dalla concentrazione di siero presente nel terreno. Una simile inibizione della crescita indotta da acido retinoico dipendente dalla densità è stata riportata con cellule di fibroblasti murini L-929 trasformati [3]. Ma nessun effetto del genere è stato riportato con le cellule di fibroblasti umani F-4 [18]. L’aumento della densità di saturazione e il ridotto fabbisogno di siero sono spesso associati allo stato trasformato delle cellule e il trattamento dell’acido retinoico sembra aver invertito queste caratteristiche.

La capacità di crescere in soft agar è un marcatore affidabile per lo stato neoplastico e abbiamo dimostrato che le cellule non trattate crescevano con alta efficienza in soft agar in condizioni in cui le cellule trattate con acido retinoico, a seconda della concentrazione di acido retinoico, crescevano con bassa efficienza o non riuscivano a formare alcuna colonia. Pertanto i risultati sono coerenti con il trattamento dell’acido retinoico che inverte lo stato neoplastico delle cellule. In una varietà di sistemi cellulari, è stato riportato che Con A si lega preferenzialmente a cellule neoplastiche e trasformate [19-27]. Abbiamo anche dimostrato che Con A si lega alle cellule tumorali del cervello umano. Ma le cellule inibite dalla crescita indotta da acido retinoico hanno mostrato una ridotta capacità di legame di Con A, indicando che il trattamento con acido retinoico potrebbe aver causato alcune alterazioni dei siti di legame di Con A sulle superfici cellulari. Inoltre, sono necessarie indagini per scoprire il numero di siti di legame Con A sulla superficie cellulare e le costanti di associazione dei siti di legame Con A delle cellule trattate e non trattate. Tutti i risultati dimostrano che la sottoclasse della linea di tumori cerebrali umani utilizzata in questo studio risponde al trattamento dell’acido retinoico che potrebbe aver soppresso il fenotipo trasformato con conseguente espressione di determinate proprietà associate alle cellule normali.