La citocalasina B influenza l’organizzazione del citoscheletro e il potenziale osteogenico delle cellule staminali mesenchimali umane della gelatina di Wharton – Cytochalasin B Influences Cytoskeletal Organization and Osteogenic Potential of Human Wharton’s Jelly Mesenchymal Stem Cells

La citocalasina B (CB) è l’ultima molecola su cui stava studiando il Prof. Luigi Di Bella per le sue proprietà antitumorali. La Fondazione Di Bella ha finanziato progetti di ricerca su questa molecola. In questo lavoro, il team di ricerca del prof Carlo Ventura dell’Università di Bologna, ha testato gli effetti della CB su cellule mesenchimali derivata da cordone ombelicale. Nello specifico è stato esaminato come la CB influenza il citoscheletro, la proliferazione e la capacità delle cellule staminali di differenziarsi in osso (potenziale osteogenico). La struttura interna della cellula, il citoscheletro, è infatti fondamentale per controllare la forma, la crescita (proliferazione), la mobilità, l’invecchiamento e il differenziamento delle cellule. Il citoscheletro influenza il destino delle staminali mesenchimali attraverso la percezione e la trasmissione di forze meccaniche.
I risultati di questa ricerca hanno dimostrato che:
1) La citocalasina B (CB) ha causato una riduzione dose dipendente del numero di cellule vive. La CB non ha aumentato l’apoptosi, la morte cellulare, ma ha determinato un rallentamento della crescita.
2) La CB ha ridotto la capacità di migrazione delle cellule mesenchimali, coerentemente con la riduzione della proliferazione, effetti reversibili una volta rimossa la CB.
5) La CB ha indotto alterazioni della forma cellulare progressive con l’aumentare della concentrazione. Questi cambiamenti erano accompagnati da una riorganizzazione del citoscheletro, dose-dipendente. L’azione era su fibre di actina, vimentina e vinculina. La CB ha aumentato anche la rigidità e la viscosità cellulare in modo dose-dipendente.
7) La CB ha potenziato la capacità delle cellule studiate di differenziarsi in osteociti (formazione ossea). Ha aumentato i depositi di calcio rispetto ai controlli, aumentato l’espressione dei marcatori osteogenici e di geni legati all’autofagia, un processo coinvolto nel potenziamento osteogenico.
Lo studio quindi ha messo in luce la potenzialità di questa molecola come antiproliferativo, per rallentamento e blocco della crescita cellulare, senza apoptosi (morte cellulare), antimetastatico per riduzione della mobilità cellulare e prodifferenziante (blocco della divisione e della mutabilità). Proprietà antitumorali molto utili e ricercate nel Metodo Di Bella.

Autore: Pampanella et al.
Data: 2023
Rivista: Pharmaceuticals 2023, 16, 289.
Argomento: altre letture, citocalasina B
Accesso libero: si
DOI/URL: https://doi.org/10.3390/ph16020289
BLOG: https://www.metododibellaevidenzescientifiche.com/2025/09/24/pampanella-et-al-2023/
PANORAMICA AUDIO (IA): https://youtu.be/6RKW1B5uJJw
Parole chiave: citocalasina B; cellule staminali mesenchimali della gelatina di Wharton; citoscheletro; proliferazione cellulare, osteogenesi; differenziamento, espressione genica;
Traduzione: La sezione “Materiali e Metodi” non è stata tradotta. Le sezioni “Riassunto” e “Introduzione” sono state tradotte in modo fedele. La sezione “Risultati” e “Discussione” sono state semplificate.

Punti di interesse: CONSIDERAZIONI INTRODUTTIVE. La terapia con cellule staminali rappresenta un’importante frontiera per curare molte malattie. Le cellule staminali mesenchimali umane (hMSC) sono considerate uno strumento promettente per la medicina rigenerativa. Queste cellule, che provengono da tessuti adulti o fetali, sanno autorinnovarsi e differenziarsi in tipi cellulari specifici. L’equilibrio tra questi due processi (autorinnovamento e differenziamento) definisce il loro ruolo.
Le hMSC ottenute da tessuti perinatali, come il cordone ombelicale o il liquido amniotico, sono ideali per terapie allogeniche (trapianto tra individui diversi). In particolare, il cordone ombelicale è una fonte ricca di hMSC che possono essere isolate dalla gelatina di Wharton (hWJ-MSC). La raccolta delle hWJ-MSC è semplice, non invasiva e con pochi problemi etici, dato che il cordone ombelicale viene scartato dopo la nascita. Queste cellule sono protette da danni al DNA e dall’invecchiamento precoce per via della loro breve vita prenatale. Le hWJ-MSC mostrano caratteristiche simili alle cellule staminali embrionali, e possono differenziarsi in cellule di grasso (adipogeniche), cartilagine (condrogeniche) e osso (osteogeniche). Non formano teratomi dopo il trapianto perché esprimono in modo ridotto i geni della pluripotenza. È stato scoperto che la struttura interna della cellula, il citoscheletro, è fondamentale per controllare la forma, la crescita (proliferazione), l’invecchiamento e il differenziamento delle cellule. Il citoscheletro influenza il destino delle hMSC attraverso la percezione e la trasmissione di forze meccaniche (meccano-sensing e meccano-trasduzione). Per esempio, per diventare cellule di grasso (differenziamento adipogenico), le MSC perdono la rigidità del citoscheletro e diventano rotonde, smontando le aderenze focali. Al contrario, la formazione dell’osso (differenziamento osteogenico) è favorita da un citoscheletro più rigido e ordinato. Sappiamo anche che se il citoscheletro si rilassa, le MSC esprimono geni di staminalità.

Le citocalasine sono molecole prodotte da funghi che possono alterare la dinamica del citoscheletro. Tra queste, la Citocalasina B (CB) blocca l’assemblaggio dei microfilamenti di actina. La CB causa cambiamenti nella forma e nelle proprietà delle cellule. La CB ferma il ciclo cellulare nella fase G2/M impedendo la formazione del fuso mitotico. Se la CB viene rimossa, le cellule riprendono il loro ciclo e ripristinano il citoscheletro di actina. Inoltre, la CB impedisce alle cellule di completare la divisione citoplasmatica, creando cellule più grandi e con più nuclei. La CB influenza anche la migrazione e il differenziamento cellulare. In un nostro studio precedente, la CB aveva potenziato il differenziamento in grasso nelle cellule staminali adipose umane (hASC).

In questo studio, è stato esaminato come la CB influenzi il citoscheletro e la capacità delle hWJ-MSC di differenziarsi in osso (potenziale osteogenico). Le hWJ-MSC sono state trattate con CB per 24 ore a diverse concentrazioni per studiare la tossicità e gli effetti su numero, crescita (proliferazione), forma e organizzazione del citoscheletro, concentrandosi sull’actina, sulla vinculina (componente delle aderenze focali) e sulla vimentina (filamenti intermedi). È stato anche analizzata l’espressione dei geni legati al ciclo cellulare e alla staminalità. Successivamente, la microscopia a forza atomica (AFM) è stata usate per vedere come la CB, in 24 ore, modifichi le proprietà nanomeccaniche delle cellule in relazione ai cambiamenti osservati. Infine, data l’importanza delle proprietà meccaniche per il differenziamento , abbiamo valutato se la CB influenzi la capacità delle hWJ-MSC di diventare cellule ossee (differenziamento osteogenico).

RISULTATI. Lo studio si è concentrato sugli effetti della Citochalasina B (CB) sulle cellule staminali mesenchimali derivate dalla gelatina di Wharton (hWJ-MSCs), analizzandone la caratterizzazione, gli effetti su numero, proliferazione, morfologia, citoscheletro, proprietà meccaniche e capacità di differenziamento in osso.
1) Le hWJ-MSCs utilizzate nello studio hanno dimostrato di possedere le tipiche caratteristiche delle cellule staminali mesenchimali (MSC), esprimendo i marcatori di superficie tipici, risultando negative per i marcatori emopoietici, mostrando la classica forma fibroblastica ed essendo in grado di differenziarsi in linee adipogeniche, osteogeniche e condrogeniche.
2) La Citochalasina B ha causato una riduzione del numero di cellule vive che dipendeva dalla dose somministrata, specialmente alle concentrazioni più alte (3 µM e 5 µM). Questa diminuzione non era dovuta a morte cellulare, poiché la CB non ha aumentato l’apoptosi, mantenendo un’alta vitalità cellulare anche dopo esposizione prolungata.
3) La riduzione nel numero cellulare era invece collegata a un rallentamento della crescita. Il trattamento con CB ha diminuito la percentuale di cellule in divisione in modo dose-dipendente. L’analisi del ciclo cellulare ha rivelato che la CB a 1 µM provocava un arresto, aumentando la percentuale di cellule nella fase G0/G1 e diminuendo quelle nelle fasi S e G2/M. È importante notare che la CB non ha alterato l’espressione di un marcatore di staminalità.
4) La CB ha anche ridotto la capacità di migrazione delle hWJ-MSCs, coerentemente con la riduzione della proliferazione, ma tali effetti sulla migrazione e sulla proliferazione erano reversibili una volta rimossa la CB.
5) A livello morfologico, la CB ha indotto alterazioni progressive con l’aumentare della concentrazione. A 1 µM, le cellule apparivano allargate e diffuse. A 3 µM, le cellule perdevano la forma fibroblastica e diventavano più arrotondate. Questi cambiamenti erano accompagnati da una riorganizzazione del citoscheletro, dose-dipendente. A 3 µM, le fibre di actina si localizzavano solo a livello corticale, la vimentina formava cluster, e la distribuzione della vinculina era modificata. Si è osservata anche la comparsa di cellule multinucleate con l’aumento della concentrazione di CB.
6) Coerentemente con la riorganizzazione del citoscheletro, la CB ha aumentato la rigidità e la viscosità cellulare delle hWJ-MSCs in modo dose-dipendente, un effetto valutato tramite microscopia a forza atomica (AFM).
7) Infine, la CB ha potenziato la capacità delle hWJ-MSCs di differenziarsi in osteociti (formazione ossea). Sebbene il numero cellulare si riducesse dopo 21 giorni di differenziamento, la vitalità rimaneva alta. La CB, in particolare a 1 e 3 µM, ha aumentato i depositi di calcio rispetto ai controlli, un effetto progressivo nel tempo. La CB ha anche influenzato l’espressione dei marcatori osteogenici e ha aumentato l’espressione di geni legati all’autofagia, un processo coinvolto nel potenziamento osteogenico. Un esperimento di *wash-out* ha dimostrato che la promozione dell’osteogenesi da parte della CB è legata al mantenimento dell’alterazione dell’organizzazione del citoscheletro F-Actina.

DISCUSSIONE. Lo studio si è concentrato sulla Citochalasina B (CB), nota per influenzare il citoscheletro, e sul suo impatto sulle cellule staminali mesenchimali prelevate dalla gelatina di Wharton del cordone ombelicale (hWJ-MSC). Queste cellule perinatali sono considerate una fonte ideale e sicura per le terapie cellulari.
I risultati hanno dimostrato che la CB modifica diverse proprietà delle hWJ-MSC, tra cui morfologia, proliferazione e destino osteogenico. Il trattamento con CB ha causato alterazioni morfologiche dipendenti dalla dose: a basse concentrazioni (1 µM) le cellule si allargavano mantenendo fasci di actina e grandi adesioni, mentre ad alte concentrazioni (3 µM) diventavano più arrotondate, con l’actina che si ritirava in periferia e la vimentina (filamenti intermedi) che formava grappoli perinucleari.
Queste modifiche strutturali hanno portato a un aumento dose-dipendente della rigidità e della viscosità cellulare, misurato tramite la microscopia a forza atomica (AFM).
La CB ha rallentato la crescita cellulare (proliferazione) in modo dipendente dalla dose, ma senza uccidere le cellule (alta vitalità). Questo effetto era dovuto all’arresto del ciclo cellulare nella fase G0/G1, dimostrato sia dall’analisi citofluorimetrica sia dalla ridotta espressione dei geni di proliferazione e dal contestuale aumento dei geni inibitori del ciclo (come p16 e p21). L’effetto sulla proliferazione era reversibile una volta che la CB veniva rimossa.
L’insieme di bassa proliferazione, aumentata rigidità e specifiche riorganizzazioni citoscheletriche ha indirizzato le hWJ-MSC verso la differenziazione ossea. Effettivamente, la CB ha potenziato la differenziazione osteogenica, aumentando i depositi di calcio e l’espressione di marcatori ossei. Questo potenziamento è risultato legato all’alterazione persistente del citoscheletro, poiché la rimozione della CB eliminava l’effetto sull’espressione dei marcatori osteogenici. Inoltre, la CB ha aumentato l’espressione di proteine coinvolte nell’autofagia, un processo che potrebbe contribuire a sostenere il programma osteogenico, potenzialmente innescato dall’azione inibitoria della CB sul trasporto del glucosio.
Infine, lo studio ha evidenziato la complessità del ruolo della CB e dell’actina: sebbene la CB abbia aumentato la rigidità e promosso l’osteogenesi nelle hWJ-MSC, lo stesso farmaco a pari concentrazione aveva precedentemente promosso la differenziazione in grasso (adipogenesi) in un altro tipo di cellula staminale (hASC), suggerendo che l’effetto sul destino cellulare dipenda in modo complesso dal tipo specifico di cellula staminale mesenchimale.

Traduzione articolo

Riassunto
Tra le cellule staminali perinatali del cordone ombelicale, le cellule staminali mesenchimali umane a gelatina di Wharton (hWJ-MSC) sono di grande interesse per gli approcci di terapia cellulare in medicina rigenerativa, mostrando alcuni vantaggi rispetto ad altre MSC. Infatti, le hWJ-MSC, posizionate tra le MSC embrionali e quelle adulte, non sono tumorigeniche e vengono raccolte con pochi problemi etici. Inoltre, queste cellule possono essere facilmente coltivate in vitro, mantenendo sia le proprietà staminali che un elevato tasso proliferativo per diversi passaggi, nonché una capacità di differenziazione trilineare. Recentemente, è stato dimostrato che l’organizzazione del citoscheletro influenza la biologia delle cellule staminali. Tra le molecole in grado di modularne la dinamica, la citocalasina B (CB), una micotossina citopermeabile, influenza la polimerizzazione dei microfilamenti di actina, influenzando così diverse proprietà cellulari, come la capacità delle MSC di differenziarsi verso uno specifico target. In questo studio, abbiamo studiato per la prima volta gli effetti di un trattamento di 24 ore con CB a diverse concentrazioni (0,1–3 μM) sulle hWJ-MSC. Il CB ha influenzato l’organizzazione del citoscheletro in modo dose-dipendente, inducendo cambiamenti nel numero cellulare, nella proliferazione, nella forma e nelle proprietà nanomeccaniche, promuovendo così l’impegno osteogenico delle hWJ-MSC, come confermato dall’analisi dell’espressione dei marcatori osteogenici/autofagici.

File pdf della traduzione di Pampanella et al. (2023) “La citocalasina B influenza l’organizzazione del citoscheletro e il potenziale osteogenico delle cellule staminali mesenchimali umane della gelatina di Wharton – Cytochalasin B Influences Cytoskeletal Organization and Osteogenic Potential of Human Wharton’s Jelly Mesenchymal Stem Cells” Pharmaceuticals 2023, 16, 289.